深圳市宝安康生物技术有限公司
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猪瘟病毒RT-PCR 检测试剂盒
猪瘟病毒RT-PCR 检测试剂盒
【试剂盒简介】
猪瘟病毒RT-PCR 检测试剂盒，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测疑似感染动物血清或组织中的CSFV，适用于CSFV 的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒不能区分强弱毒。
【原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【试剂盒组份】
| 1. 裂解液 | 8mL | 8. 吸附柱和收集管 | 12套 |
| 2. BME | 85μL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15个 |
| 3. 异丙醇 | 8mL | 10. RT-PCR 反应液A | 200μL |
| 4. 洗涤液 | 15mL | 11. RT-PCR 反应液B | 25μL |
| 5. 洗脱液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 电泳缓冲液 | 20mL |
| 6. 阴性对照 | 500μL | 13. 染色液 | 10μL |
| 7. 阳性对照 | 500μL |
| 提示：1. 塑料袋内试剂（阳性对照、RT-PCR反应液A和B）-20 ℃冻存，其他室温保存。2. 裂解液使用前请加入77.6µL BME，混匀后于4℃保存。【需自备的材料】生理盐水、组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯（DEPC ）处理的灭菌1.5mL 离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）。【注意事项】1．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期的试剂，试剂盒之间的组分不要混用。2．所有试剂应在规定的温度储存，使用时拿到室温下，使用后立即放回。3．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。4．严格按试剂盒说明书操作可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。5．RNA提取过程中，应戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。6．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。【操作方法】一、样品制备1 样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5 mL，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）2 样品处理：2.1 组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。2.2 全血样品的处理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。2.3 阳性对照的处理：取阳性对照 200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。2.4 阴性对照的处理：取阴性对照200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。二、病毒RNA的提取1. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL裂解液（请确认已加入BME），充分颠倒混匀，室温静置10min 。2. 加入600µL异丙醇，颠倒混匀。3. 将混合液吸入吸附柱中（吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。4. 向吸附柱中加入600µL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。5. 重复步骤4一次。6. 空柱12,000 rpm 离心2 min。7. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在膜中央加入25µL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。三、RT-PCR1. 反应体系配制：每份总体积20 µL，分别取16µL RT-PCR反应液A（用前混匀）、2µL RT-PCR反应液B（用前混匀）和2µL模板RNA，混匀。2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、55℃ 45 s 、72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。四、电泳1. 制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。2. 电泳：待胶凝固后，取5µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。3. 染色：取50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。【结果判断】 阳性对照出现368bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现368bp扩增带为猪瘟病毒阳性，否则为阴性。 |
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猪瘟病毒RT-PCR 检测试剂盒
【试剂盒简介】
猪瘟病毒RT-PCR 检测试剂盒，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测疑似感染动物血清或组织中的CSFV，适用于CSFV 的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒不能区分强弱毒。
【原理】
利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【试剂盒组份】
| 1. 裂解液 | 8mL | 8. 吸附柱和收集管 | 12套 |
| 2. BME | 85μL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15个 |
| 3. 异丙醇 | 8mL | 10. RT-PCR 反应液A | 200μL |
| 4. 洗涤液 | 15mL | 11. RT-PCR 反应液B | 25μL |
| 5. 洗脱液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 电泳缓冲液 | 20mL |
| 6. 阴性对照 | 500μL | 13. 染色液 | 10μL |
| 7. 阳性对照 | 500μL |
| 提示：1. 塑料袋内试剂（阳性对照、RT-PCR反应液A和B）-20 ℃冻存，其他室温保存。2. 裂解液使用前请加入77.6µL BME，混匀后于4℃保存。【需自备的材料】生理盐水、组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、经焦碳酸二乙酯（DEPC ）处理的灭菌1.5mL 离心管和吸头（10 µL、200 µL、1000 µL）。【注意事项】1．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期的试剂，试剂盒之间的组分不要混用。2．所有试剂应在规定的温度储存，使用时拿到室温下，使用后立即放回。3．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。4．严格按试剂盒说明书操作可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。5．RNA提取过程中，应戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。6．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。【操作方法】一、样品制备1 样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5 mL，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）2 样品处理：2.1 组织样品的处理：称取组织0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。2.2 全血样品的处理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 灭菌离心管中。2.3 阳性对照的处理：取阳性对照 200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。2.4 阴性对照的处理：取阴性对照200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。二、病毒RNA的提取1. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL裂解液（请确认已加入BME），充分颠倒混匀，室温静置10min 。2. 加入600µL异丙醇，颠倒混匀。3. 将混合液吸入吸附柱中（吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱），12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。4. 向吸附柱中加入600µL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。5. 重复步骤4一次。6. 空柱12,000 rpm 离心2 min。7. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在膜中央加入25µL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。三、RT-PCR1. 反应体系配制：每份总体积20 µL，分别取16µL RT-PCR反应液A（用前混匀）、2µL RT-PCR反应液B（用前混匀）和2µL模板RNA，混匀。2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、55℃ 45 s 、72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。四、电泳1. 制胶：用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。2. 电泳：待胶凝固后，取5µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。3. 染色：取50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液30mL，加入10µL染色液，混匀后将胶浸泡30min，于紫外灯下观察结果。【结果判断】 阳性对照出现368bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现368bp扩增带为猪瘟病毒阳性，否则为阴性。 |